普洱茶中的金花研究
作者簡介
張理珉 云南大學生命科學學院 副教授，國家標準《地理標志產品 普洱茶》主要起草人，圍繞著云南茶葉深加工，從事普洱茶微生物和發(fā)酵工藝技術研究。
程立忠 云南大學生命科學學院 副教授，主要從事微生物學方面教學和科研 工作。
2010 年，一個偶然的機會，當時由云南省質量檢測院的張學忠副院長介紹一位茶企的老總認識，說是在公司的一款 500 克普洱茶(熟茶)方磚中間有較多的金黃色顆粒，讓我們幫忙研究一下是什么微生物產生的?
通過顯微鏡觀察其上“ 金黃色的顆粒 ”為真菌中子囊菌的有性生殖過程形成的子實體 —— 子囊果中的閉囊殼，肉眼觀察呈金(亮)黃色粗大顆粒(有別于黃曲霉細粉狀暗黃色無性分生孢子)，俗稱“金花”，原有報
道廣泛存在于黑茶中，是湖南安化、陜西涇陽茯(磚)茶等黑茶中的有益優(yōu)勢菌，在其發(fā)酵茶產品品質中起著關鍵性作用。
既然在普洱茶緊壓茶中也有其蹤跡，從而說明普洱茶生產加工過程中有適合“ 金花”菌生長的條件，基于其是否會對普洱茶品質的影響深入了解的目的，于當年我們進行茶葉市場走訪，尋找普洱茶中有金黃色的顆粒的相關茶樣，前后共收集了 30 多個樣品，發(fā)現在壓得較緊的生茶、熟茶里都存在其身影。后經在實驗室通過科學的分離純化研究發(fā)現，這些“金花”微生物還是分屬不同的種類(菌落形態(tài)、營養(yǎng)需求等存在明顯不同)，但主要是散囊菌屬(Eurotium )中的一些菌種產生的。
茶葉中“金花”是什么?
茶葉中“ 金花 ”是一類真菌，和云南常見珍貴野生菌中的羊肚菌、塊菌等一樣，同屬真菌界子囊菌門(Ascomycota)，但其不能產生大型肉質子實體。屬于子囊菌綱 (Ascomycetes)、散囊菌目(又稱曲霉目或不整囊菌目，Eurotiales)、曲霉科 (Eurotiaceae)、散囊菌屬(Eurotium)，為灰綠曲霉群的有性型屬 , 其主要特征為子囊果原基明顯 ,在營養(yǎng)菌絲上形成螺旋狀產囊體 ; 子囊果為閉囊殼型 , 通常為黃色 , 球形或近球形 , 具有一層細胞厚的擬薄壁組織壁 , 內生若干子囊孢子(子囊壁早期消解匯集一體); 子囊孢子呈雙凸鏡形 , 光滑或具不同紋飾。
無性型產生輻射狀或疏松柱狀的分生孢子頭 , 大多呈灰綠色 ; 產孢結構(小梗)單層 , 稍粗大 ; 分生孢子球形、卵形至洋梨形 , 大多帶綠色 , 較大 , 具小刺[1]。
本屬可承認的分類群(種)約 20 個，我國已報道 11 個。
我國大量邊銷的茯磚茶，以其中“金花”(即茶磚上的“小黃點”)的多少作為鑒定品質好壞的重要標志，這些黃色小點實際上是散囊菌屬(Eurotium )某些菌種產生的黃色閉囊殼，被認為是茯磚茶等黑茶發(fā)酵中的優(yōu)勢有益菌(徐國幀，1945;倉道平和溫瓊英，1981;齊祖同和孫曾美，1990;劉作易等，1990)。
現今對茯磚茶存在的“金花”研究較為深入，主要優(yōu)勢菌種為冠突散囊菌(Eurotium cristatum )，因生長繁殖時會產生金黃色的閉囊殼，俗稱“金花”，在高倍放大鏡下，“金花”呈金黃色，形狀如球形蘑菇。
目前根據我們的調查采樣分離，反映“金花”也普遍存在于普洱緊壓茶中，但人們對普洱茶中產“金花”的現象和“金花”微生物研究較少，對其系統(tǒng)化研究甚少，更談不上深入的了解、認識和研究。通過我們的研究發(fā)現“金花”菌在普洱茶的出現，也是在特定條件形成的，在實際樣品中其對茶外觀和內質都有很大影響，對色、香、味等品質形成上起到重要作用，使普洱生茶在短期內可以形成老生茶的相關品質，同時使其具備一定特殊菌香特質等，主要是來源于兩方面的作用因素：
①“金花菌”生長中產生的各種代謝酶類對原料中原有內含物 ( 纖維素、果膠質、淀粉、蛋白質、脂肪、多酚類等 ) 的降解、轉化、聚合等作用而形成新型物質;
②“金花”菌在其生長過程中新生代謝產物 ( 尤其次生代謝物 ) 的合成積累釋放，從而明顯改善和提升了普洱茶的品質。目前，我們根據“金花菌”生長條件和規(guī)律、營養(yǎng)需求等方面研究結果和結論，形成人工控制下的發(fā)花技術應用于大葉種曬青“金花”緊壓茶的生產，從而進一步提升了茶品的品質——口感甜、潤感明顯，菌香濃郁，原有苦澀感明顯減弱。
我們的研究進展
以云南茶葉資源和“金花”菌的利用及深加工，圍繞新型產品開發(fā)為目的，得到了云南大學“雙一流”項目的大力支持，做了一些基礎性和茶葉產品開發(fā)研究的工作。
1、設計全新分離純化培養(yǎng)用培養(yǎng)基(固體平板培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基)以及培養(yǎng)條件，得到多株在普洱茶和分離平板上均可以產生“金花”——真菌有性繁殖結構子囊果閉囊殼(圖 1)，但在平板菌落形態(tài)上存在較大的差異(圖 2)。
通過相關樣品分離純化后根據菌落形態(tài)篩選出 4 株產“金花”的菌株作為重點研究對象，通過分子生物學測序(ITS、18S rDNA)鑒定，均為散囊菌屬的不同種(其無性系顯示為曲霉菌屬、青霉屬)，反映了普洱茶來源菌株的多樣性：
1 號菌為雞油曲霉(Aspergillus cibarius)。
2 號菌為赤散囊菌(Eurotium rubrum)。
3 號菌為蠟葉散囊菌(Eurotium herbariorum)。
4 號菌為冠突散囊菌 (Eurotium cristatum )。
針對以上 4 株菌進一步進行了察氏培養(yǎng)基菌落形態(tài)分類學鑒定(見圖 5，4 號菌)、掃描電子顯微鏡形態(tài)觀察(見圖 6，4 號菌)等研究，同時結合前期分子生物學鑒定的結果，4 號菌最終鑒定為：冠突散囊菌 (Eurotium cristatum )。
根據分類鑒定的結果，結合實驗室小試“發(fā)花”試驗及品審結果，篩選了生長快、“金花”發(fā)育好、對“發(fā)花”后茶葉品質提升明顯的 4 號菌株用于生產菌株，對其發(fā)花工藝技術進行詳細的研究。
其發(fā)花工藝大體為以云南大葉種曬青茶為為原料，經過菌劑培養(yǎng)、蒸壓、發(fā)花、干燥等工藝得到的“金花緊壓茶”科研產品，送云南省產品質量檢驗所檢測(以普洱生茶、伏磚茶標準為參考，能檢盡檢)，結果顯示：產品各項指標符合茶葉相關標準，未有不合格項，其中：冠突散囊菌數量為 9.7×10 CFU/g(> 20×10 CFU/g，伏磚茶標準);真菌毒素(8 個)未檢出。
感官審評結論為：該科研產品工藝上引入了發(fā)花工藝，感官品質具有普洱茶(生茶)特性的同時，菌香明顯、滋味醇厚鮮甜，干評金花豐富，產品具有一定創(chuàng)新性。
近年來有學者，針對黑茶中產“金花”的微生物進行了研究，反映出不同茯磚茶企業(yè)成品樣品經分離、純化、鑒定存在發(fā)花形成“金花”菌種的多樣性，以冠突散囊菌(Eurotium cristatum ) 為主，同時還存在謝瓦散囊菌 (Eurotiumchevalieri )、肋狀散囊菌 (Eurotium costiforme )、蠟葉散囊菌 (Eurotium herbariorum ) 和阿姆斯特丹散囊菌(Eurotium amstelodami) 等菌株。
我們對普洱茶中產“ 金花 ”微生物研究反映了“ 金花”微生物雖說不是普洱茶發(fā)酵中的優(yōu)勢菌，但也非難覓其蹤，普遍存在一些特定環(huán)境和加工成形的茶品中，針對分離純化的部分菌株進行鑒定的結果顯示分屬不同的種，也呈現出種的多樣性。
同時，培養(yǎng)物的菌落形態(tài)特征表現不同;培養(yǎng)營養(yǎng)要求有較大差異;應用發(fā)花后的茶葉品質存在較大不同，有部分還帶來了負面的結果。
茶葉與冠突散囊菌共效
茶葉作為我國有悠久歷史傳統(tǒng)飲品，世界三大飲品之一，其味微苦、甘，性涼，內含物有諸多功效，如抗氧化、提神醒腦、清熱解毒、利尿消腫、抗炎殺菌、止咳生津等。
圖 6 4 號菌電鏡觀察結果
上左：顯示完整子囊果閉囊殼(含菌絲);上右：人為破壁子囊果及子囊孢子;下：子囊孢子(具冠突結構)圖 7 4 號菌“發(fā)花”產品的內部“金花”生長情況
(顯示“金花”生長茂盛)冠突散囊菌作為一種益生菌參與茶葉發(fā)酵中，其在茶葉上生長繁殖代謝過程中，利用茶葉中的營養(yǎng)物可以產生多種初、次生代謝活性產物，同時，抑制有害菌的生長，對茶葉中內含物進行了再加工轉化，使之發(fā)酵過茶品功效得到了提升和擴展，可以達到食療兼收的目的。
總之，茶葉與冠突散囊菌共效主要包括改善茶葉品質、抗氧化、抵制有害菌(細菌、病毒等)、提高人體免疫、預防腫瘤、提高酶的活性、以及調節(jié)維持腸道微生物菌群平衡等。
“金花”茶生產過程中
會碰到的問題
1、產“ 金花 ”茶品中相關菌種的多樣性，從而伏茶、六堡茶、普洱茶等自然發(fā)花生成“ 金花 ”不一定都是冠突散囊菌，還有其它相關菌種參與生成;冠突散囊菌的不同菌株的發(fā)酵能力也不盡相同，這兩方面的原因給生產帶了諸多不確定因素——品質是否得到提升，安全性、穩(wěn)定性如何等。
2、基于上述發(fā)花菌種存在的問題，需要積極開展人工接種發(fā)酵的研究(酸奶制作就是成功的例子)。首先，性狀優(yōu)良菌種收集、鑒定、發(fā)酵性能、成品品質和安全性的測定就成了當務之急;其次，是人工接種的操作工藝流程和要求，接種后冠突散囊菌在茶葉上的促生長發(fā)酵(發(fā)花)條件的控制，接種及發(fā)酵過程中雜菌(黑曲霉等)污染問題的解決。
3、結合已發(fā)現的相應生物學功效 ( 對人體部分重要指標的改善、細胞損傷的修復等 )，需要加強基礎性研究，主要從代謝產物的提取和成分分析、生理活性與健康功效對應機制等方面開展探索性研究，拓寬其應用領域。
4、通過菌種篩選、馴化及發(fā)酵條件的控制，降低成品茶中發(fā)酵腥味(粗青味等)和酸味等不良氣味和滋味過重的問題。提升產品滋味的醇和度和爽口性，使之形成甜潤滑生津回甘，并具特殊菌香的優(yōu)良產品。
原文節(jié)選自《普洱》雜志
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